SUMMARY HPLC

1.      Prinsip Kerja Analisa Pangan Menggunakan HPLC

Jawab:

            Memisahkan senyawa berdasarkan perbedaan polaritas melalui fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase) pada suhu kamar. Jika polaritas senyawa analit lebih mirip dengan fase diam, maka senyawa tersebut akan tertinggal di fase diam atau bergerak lebih lambat. Jika polaritas senyawa analit lebih mirip dengan fase gerak maka senyawa tersebut akan bergerak lebih cepat di fase gerak.

2.      Mekanisme Kerja Mesin HPLC

Jawab:

Mekanisme kerja HPLC dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen senyawa. Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi menggunakan fase gerak dengan bantuan pompa (laju 1-1 mL/menit). Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom berdasarkan perbedaan polaritas. Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi dengan detektor yang sesuai dengan perbedaan kecepatan elusi dan dilaporkan pada kromatogram. Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak. Untuk analisis kualitatif digunakan informasi tR, sedangkan untuk analisis kuantitatif digunakan informasi luas area/tinggi puncak kromatogram.

3.      Metode HPLC Lebih Cocok Untuk Analisa Pangan yang Karakteristik Fisik Kimiawinya Seperti Apa?

Jawab:

HPLC cocok untuk semua bahan pangan. HPLC dapat digunakan untuk menetapkan kadar senyawa seperti asam amino, karbohidrat dan gula turunannya, asam nukleat dan protein dalam cairan fisiologis, dan komponen bioaktif. HPLC juga dapat digunakan untuk emisahan senyawa organik, anorganik, senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities), pemurnian senyawa, pemisahan senyawa yang strukturnya hampir sama, identifikasi trace element, analisis senyawa non volatile, penentuan molekul netral, ionik, maupun zwitter ion.

4.      Gambar dan Terangkan Komponen HPLC!

Jawab:

Gambar 1. Perangkat HPLC

            Perangkat dasar instrumen HPLC terdiri dari beberapa rangkaian alat antara lain microprocessor control, pompa bertekanan tinggi, injektor, kolom, detektor, recorde, dan wadah fase gerak. Fungsi masing-masing bagian HPLC tersebut adalah sebagai berikut:

1. Microprocessor control

            Microprocessor control atau mikro komputer berperan mengontrol kecepatan aliran pelarut (flow rate), mengatur tekanan (pressure), mengatur komposisi/perbandingan pelarut, mengatur suhu injektor dan jumlah sampel yang akan diinjeksikan bila menggunakan automatic injection, mengatur suhu oven termasuk suhu kolom, mengatur panjang gelombang pada detektor dan memprogram waktu analisa yang diperlukan apabila menggunakan HPLC sistem gradien.

2. Pompa

            Pompa berperan memompakan pelarut secara terus menerus dengan kecepatan aliran yang tetap dari reservoar ke kolom sambil membawa sampel dari injektor melewati kolom ke detektor dan akhirnya ke pembuangan. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut. Bahan yang umum digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor. Pompa minimal bertekanan 100 arm (1500 psi, pound per square inch) dan maksimal 400 arm (6000 psi) sesuai dengan besar aliran (flow rate berkisar antara 0,5-2 ml/min), tipe kolom, ukuran partikel adsorban dalam kolom (mesh), dan panjang kolom yang digunakan. Untuk mengerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa.

3. Injektor

            Injektor adalah alat untuk memasukkan sampel ke dalam kolom yang dapat dilakukan secara otomatis ataupun manual. Bila HPLC dilengkapi dengan automatic sample injector maka injeksi sampel dapat dilakukan secara otomatis yaitu dengan memprogram pada microprocessor control. Sedangkan secara manual yaitu dengan menggunakan jarum suntik khusus (volume 10-20 uL). Injektor harus mampu bekerja pada tekanan 470 arm, suhu 150 °C, dengan kesalahan (error) kurang dari 0,2 %. Terdapat tiga jenis injektor, yaitu stop flow (injeksi dilakukan pada sistem tertutup dan aliran dihentikan), septum (diinjeksikan sampai 60-70 atmosfer langsung ke aliran fase gerak seperti pada kromatografi gas), loop valve (untuk menginjeksi volume lebih besar daripada 10 µl). Pada posisi LOAD, sampel dalam putaran diisi pada tekanan atmosfir. Pada Gambar 2 ditunjukkan bila katup difungsikan, maka sampel di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.

Gambar 2. Posisi inject (kiri), dan posisi load (kanan) pada loop valve

5.      Kolom

            Kolom berfungsi sebagai tempat proses pemisahan senyawa analit. Kolom umumnya dibuat dari stainless steel berbentuk tabung dengan panjang 10-30 cm yang mampu menahan tekanan (setinggi 680 atm) dan tidak bereaksi dengan pelarut (fase bergerak). Fase diam (adsorban) dalam kolom harus halus dengan keseragaman diameter yang sama (uniform bore diameter). Kolom berbentuk tabung harus lurus dan diletakkan pada posisi vertikal serta diperlengkapi dengan fitting dan konektor yang didesain agar tidak memberikan kehampaan pada ujung kolom. Kolom dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi. Kolom dapat dibagi menjadi dua, yaitu:

a.       Kolom analitik: Berdiameter 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm. Untuk kemasan mikropartikel berpori, umumnya 10-30 cm.

b.      Kolom preparatif: Umumnya berdiameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25-100 cm.

            Kolom dapat diklasifikasikan berdasarkan diameter, panjang dan kegunaannya, menjadi:

a.       Kolom Standard: Kolom standard HPLC mempunyai diameter 4-5 mm. Ini adalah kolom siap pakai yang mempunyai keseragaman ukuran partikel adsorban dan secara mekanik sangat stabil.

b.      Kolom Radial Compression: Kolom ini mempunyai diameter yang lebih besar, sehingga responnya terhadap kecepatan aliran, tekanan, waktu retensi dan intensitas puncak menurun. Penggunaan kolom ini memberikan keuntungan karena akan menurunkan semua operasional HPLC seperti tekanan dan waktu analisis (bila aliran pelarut dinaikkan). Kolom ini terbuat dari plastik (cartridge) dengan diameter 8 mm dan panjang 10 cm, diperlengkapi dengan pegangan (holder) plastik. Pemisahan akan terjadi apabila kolom mengalami tekanan dari pelarut yang dialirkan sehingga terjadi radial compression, karena adanya lapisan gliserol di dalam kolom yang memberikan kelenturan pada dinding kolom. Setelah pemisahan selesai, kolom kembali ke keadaan semula.

c.       Kolom Narrow-Bore: Kolom ini terbuat dari bahan metal anti karat seperti kolom standard. Diameternya yaitu 1-2 mm dan panjangnya 5-8 cm. Penggunaan kolom ini harus diikuti dengan menggunakan pelarut yang mempunyai kualitas tinggi, karena kolom ini sangat sensitif dan akurasinya sangat tinggi. Jumlah sampel yang diinjeksikan harus kurang dari 1 uL. Apabila lebih dari 1 uL akan memberikan tingkat gangguan (noise level) yang besar pada detektor dan tekanan sensitivitas akibat kelebihan konsentrasi.

d.      Kolom Pendek (Cepat): Kolom ini merupakan kolom konvensional yang berukuran 3-6 cm. Kolom ini mampu memberikan sensitivitas lebih tinggi dibandingkan kolom standard. Waktu yang dibutuhkan untuk satu kali analisis berkisar antara 15-120 detik untuk sistem isokratik dan 1-4 menit untuk sistem gradien. Kolom ini sangat baik digunakan untuk pekerjaan analitik dan kontrol kualitas (QC).

e.       Kolom Pengaman dan Penyaring (Guard and Filter): Untuk memperpanjang masa pakai kolom HPLC biasanya pada pangkal kolom ditambahkan pelindung terhadap pengaruh fisika dan kimiawi yaitu kolom pengaman dan penyaring yang relatif pendek biasanya 5 cm dan berisi fase diam sejenis dengan kolom yang akan dilindunginya. Secara periodik isinya dapat dikeluarkan dan diisi ulang kembali untuk mengeluarkan kotoran yang berasal dari sampel yang diinjeksikan.

6.      Detektor

            Detektor adalah alat untuk mendeteksi komponen kimia yang telah terpisah setelah melewati kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, respons linier yang luas, dan memberi respon untuk semua tipe senyawa. Detektor yang paling banyak digunakan untuk HPLC adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Detektor dapat dikategorikan menjadi beberapa yaitu:

a.      Detector RI : Detector RI (Refractive Index) disebut juga Differential Refractometer. Prinsip kerjanya adalah memonitor perbedaan indeks refraktif antara fase gerak dan eluent, kemudian memberikan respon pada bahan terlarut yang mempunyai indeks refraktif yang signifikan berbeda dari fase gerak. Alat ini mempunyai dua kompartemen (kuvet) yang salah satunya berisikan fase gerak (refferen), dan yang lainnya berisi larutan yang keluar dari kolom, sumber cahaya (monochromatic) dan dua photo detector. Perbedaan indeks refraktif dari kedua kuvet inilah yang akan diubah menjadi pulsa listrik yang akan diteruskan ke recorder untuk dirubah menjadi kromatogram.

b.      Bulk property detector: Tipe detektor ini adalah indeks refraktif yang prinsip keseluruhannya berdasarkan perbandingan pada sifat-sifat fisika dari fase gerak dengan atau tanpa bahan yang terlarut. Walaupun detektor ini umum dipergunakan, namun relatif kurang sensitif dan memerlukan kontrol temperatur yang baik.

c.       Detektor UV-Vis (Ultra Violet-Visible): Detektor ini bekerja sangat selektif pada setiap senyawa. Detektor ini dilengkapi dengan lampu ultra (UV), biasanya digunakan lampu deuterium dengan panjang gelombang 190-400 nm dan lampu sinar tampak (wolfram) dengan panjang gelombang 400-800 nm. Detektor UV-Vis dapat dibagi atas 3 kategori yaitu, 1) panjang gelombang tetap (fix wavelength), 2) panjang gelombang yang bisa diubah-ubah (variable-wavelength) dan 3) panjang gelombang otomatis (scanning wavelength) yang lebih dikenal dengan sebutan Diode Array Detector.  

d.      Solute property detector: Detektor ini memiliki sensitivitas yang tinggi dan dapat
memberikan sinyal untuk senyawa dalam jumlah relatif kecil (nanogram). Ada beberapa macam detektor tipe ini yang telah dikembangkan antara lain detektor absorbansi, fluoressen, dan elektro-kimia (amperometric).

e.       Detektor Fluorescence: Prinsip kerja dari detektor berdasarkan perbedaan pendar (emisi) dari senyawa-senyawa yang dianalisa, sehingga detektor ini hanya dapat digunakan secara selektif untuk senyawa-senyawa yang mengeluarkan emisi sinar atau senyawa yang dengan pemberian energi (sinar) akan tereksitasi dan mengeluarkan emisi sinar. Jadi detektor ini tidak dapat dipakai untuk semua senyawa kimia.

f.        Detektor Elektro-kimia (Amperometric): Prinsip detektor ini didasarkan pada karakter voltameter dari molekul senyawa yang dianalisis di dalam fase gerak air atau air-organik. Pengukuran dilakukan berdasarkan pada perbedaan potensial listrik dari molekul senyawa yang dianalisis dan fase bergerak dibandingkan dengan potensial listrik dari fase bergeraknya.

7.      Recorder dan Data Processor

            Recorder berfungsi mencatat setiap sinyal yang muncul pada detektor untuk diubah dalam bentuk kurva kromatogram. Tinggi rendahnya kurva didasarkan pada pulsa listrik yang diterima recorder dari detektor dan tergantung pada sensitivitas detektor yang digunakan. Pada beberapa HPLC, recorder dihubungkan dengan komputer untuk analisa data atau dalam bentuk yang kompak dan dikenal sebagai data processor. Data processor akan memudahkan analisa data HPLC. Informasi yang disajikan data processor antara lain, waktu retensi, peak area, prosentase (%) dan jumlah total dari setiap kurva yang dihasilkan.

8.      Wadah Fase Gerak (Reservoir)

            Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung wadah harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit. Wadah ini umumnya mampu menampung 1-2 liter pelarut

5.    Beri Contoh: Metode Analisa HPLC Untuk Analisa Pangan

Jawab:

            Penelitian yang dilakukan Kusuma dan Rosalina (2016) berjudul “Analisis Kadar Kapsaisin dari Ekstrak “Bon Cabe” Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)”. Pengujian kandungan kapsaisin pada sampel dilakukan dengan tiga tahap, yaitu penentuan kurva baku standar, preparasi sampel cabai dan analisis sampel dengan istrumen KCKT. Sampel yang diperoleh diuji dengan menggunakan KCKT. Berdasarkan kromatogram, didapatkan nilai AUC sebesar 40195 pada 227 nm dan 112344 pada 281 nm. Hasilnya, kadar kapsaisin pada sampel bubuk cabe “Bon Cabe” (No Batch 8995899250143) yaitu 2,06 ppm pada panjang gelombang 227 nm dan 16,8 ppm pada panjang gelombang 281 nm. Pemisahan senyawa kapsaisin pada panjang gelombang 281 nm lebih baik dibandingkan pemisahan senyawa pada panjang gelombang 227 nm.