REVIEW JURNAL "IMPROVEMENT OF SIMULTANEOUS DETERMINATION OF NEUTRAL MONOSACCHARIDES AND URONIC ACIDS BY GAS CHROMATOGRAPHY"

1.   Latar Belakang

            Polisakarida memiliki banyak manfaat salah satunya sebagai antitumor, antioksidan, dan antiinflamasi (Huang et al., 2015; Mao et al., 2015; Yang and Zhang, 2009). Karena itu perlu dilakukan analisa komposisi monosakarida untuk mengetahui struktur polisakarida yang kompleks. Tantangan menganalisa monosakarida diantaranya yaitu kesulitan dalam memisahkan, mendeteksi, melakukan derivatisasi asam uronat, dan mendapatkan monosakarida netral serta asam uronat (Zhang et al., 2012). Dibandingkan dengan metode analisa lain, analisa menggunakan GC paling banyak dipilih karena lebih akurat, presisi, sensitif dan efisien (Wang et al., 2017).

2.   Metode

2.1  Standard dan Reagen

            Standard yang digunakan untuk monosakarida netral yaitu L-ramnosa, D-arabinosa, L-fukosa, D-xylosa, D-manosa, D-glukosa, D-galaktosa (1,5 mg/mL). Standard yang digunakan untuk asam uronat yaitu L-asam glukuronat dan L-asam galakturonat (2 mg/mL). Reagen yang digunakan yaitu natrium borohidrat (NaBH₄), cation-exchange resin (Amberlite 732) dan trifluoroacetic acid (TFA) sebagai pelarut. Pada penelitian ini digunakan apple pomace pectic polysaccharide (APP-P), Grassleaf Sweelflag Rhizone polysaccharide (GSR-P), Agrimonia Pilosa Ledeb polysaccharide (APL-P), lactic acid bacteria exopolysaccharides (EPS), dan pretreatment effluent of biomass (PEB-P) untuk memverifikasi aplikasi metode pada penelitian ini (Wang et al., 2017).

2.2  Derivatisasi Monosakarida dan Asam Uronat

            Derivatisasi dilakukan tiga tahap proses dengan rincian pada Tabel 1 berikut:

Tabel 1. Tahap-tahap pretreatment derivatisasi Monosakarida dan Asam Uronat

Tahap	Diagram Alir Proses	Keterangan
Hidrolisis polisakarida		Pada tahap ini sampel padat polisakarida dihidrolisa menjadi monosakarida dengan cara direndam dalam 10mL larutan trifluoroacetic acid (TFA) 2M.
Reduksi gugus aldehid		Pada tahap ini terjadi hidrolisis lakton yang merupakan tahap penting sebelum reduksi. Asam aldonat dikonversi menjadi aldonolakton agar dapat bereaksi dengan n-propylamine dan asetat anhidrida
Amidasi dan asetilasi		Asam uronat akan dikonversi menjadi n-propylamine dan monosakarida akan dikonversi menjadi alditol asetat, sehingga dapat dianalisa menggunakan GC-FID

2.3  Kromatografi Gas yang Digunakan

            Kolom yang digunakan yaitu kolom kapiler jenis high performance capillary column, DB-17 (panjang 30 m, diameter internal 0,25 mm, ketebalan fase diam 0,25 mm, Agilent). Suhu injektor 250^oC dan suhu detektor 280^oC. Jumlah sampel yang diinjeksi 1 վL tanpa splitting. Gas pembawa yang digunakan yaitu N₂ dengan kecepatan alir 1,5 mL/menit. Hidrogen sebagai gas pendorong dengan kecepatan alir 60 mL/menit. Udara sebagai gas pembakar untuk detektor Flame Ionization Detector (FID) dengan kecepatan alir 450 mL/menit. Terdapat dua suhu yang diatur untuk memisahkan derivat monosakarida yaitu:

a.    TP-A (Temperature Program-A): suhu awal 180^oC dipertahankan selama 2 min, kemudian dinaikan hingga 210^oC dengan gradien linear setiap 5 menit dan dipertahankan selama 2 menit. Suhu kemudian dinaikkan kembali sebesar 0,3^oC/ menit hingga mencapai suhu 215^oC dan dipertahankan selama 20 menit. Setelah itu suhu dinaikan kembali sebesar 6^oC/ menit ke suhu akhir 240^oC dan dipertahankan sealama 10 menit, sehingga total waktu proses yaitu 60 menit.

b.    TP-B (Temperature Program-B): pengaturan suhu pada TP-B sama dengan TP-A hingga suhu 215^oC. Setelah itu suhu dinaikan sebesar 8^oC/menit hingga 240^oC dan dipertahankan selama 17 menit, sehingga total waktu proses yaitu 45 menit.

3.    Hasil dan Pembahasan

            Hasil pengujian menggunakan GC-FID pada kromatogram di Gambar 1 menunjukkan bahwa sembilan derivat monosakarida dapat terpisah dengan baik. Pada suhu 215^oC dan waktu proses 45 menit, tujuh monosakarida netral dan dua asam uronat sudah dapat terpisah dan tidak ada perbedaan signifikan antara TP-A dan TP-B. Namun TP-B dipilih untuk analisa GC karena waktu proses yang lebih pendek daripada TP-A.

Gambar 1. Kromatogram GC-FID campuran standard (A), APP-P (B), GSR-P (C), APL-P  (D), ESP (E) and PEB-P (F). Peak pada kromatogram: (1) Ramnosa; (2) Fukosa; (3) Arabinosa; (4) Xylosa; (5) Manosa; (6) Glukosa; (7) Galaktosa; (8) Asam Glukoronat; (9) Asam Galakturonat

            Berdasarkan gambar 1. ditunjukkan bahwa sampel APP-P tidak terdapat asam glukoronat. Pada sampel GSR-P hanya terdapat monosakarida jenis arabinosa, glukosa, galaktosa. Pada sampel APL-P hanya terdapat monosakarida jenis ramnosa, arabinosa, glukosa, galaktosa. Pada sampel ESP terdapat monosakarida jenis arabinosa, manosa, glukosa, galaktosa. Sedangkan sampel PEB-P mengandung monosakarida jenis ramnosa, arabinosa, xylosa, manosa, glukosa, dan galaktosa.

Tabel 2. Retention Monosakarida dan Asam Uronat

Urutan Peak	Jenis Monosakarida	Retention Time (menit)	Kandungan/mg
1	Ramnosa	11,839	0,2364
2	Fukosa	12,349	0,0006
3	Arabinosa	12,559	0,1820
4	Xylosa	13,240	0,1205
5	Manosa	23,392	0,0020
6	Glukosa	24,095	0,1528
7	Galaktosa	24,705	0,1419
8	Asam Glukoronat	36,605	Tidak terdeteksi
9	Asam Galakturonat	38,532	4,1235

           

            Tabel 2. menunjukkan bahwa monosakarida jenis ramnosa memiliki Retention Time (RT) terpendek (11,839 menit) sedangkan asam galakturonat memiliki RT terpanjang yaitu (38,532 menit). Asam galakturonat merupakan komponen dengan kandungan tertinggi di dalam sampel yaitu 4,1235. Sedangkan asam glukuronat merupakan komponen dengan kandungan terendah karena itu tidak terdeteksi. Hal ini dipengaruhi beberapa hal diantaranya:

a.    Derivatisasi: Derivatisasi bertujuan agar sampel bersifat volatil sehingga dapat dideteksi dan dipisahkan oleh GC. Pada penelitian ini tiga tahap proses derivatisasi mampu menghasilkan pemisahan peak yang baik meskipun asam glukuronat tidak terdeteksi pada sampel (Saraiva et al., 2011).

b.    Berat molekul komponen: massa molar ramnosa yaitu 164,1565 g/mol (paling ringan dibanding komponen lain) sedangkan massa molar asam galakturonat yaitu 194,139 g/mol (paling berat dibanding komponen lain), sehingga ramnosa memiliki RT paling pendek dan asam galakturonat memiliki RT paling panjang (PubChem, 2017).

c.     Injeksi sampel: Sampel diinjeksikan secara langsung sebanyak 1 վL tanpa splitting. 100% sampel yang telah diinjeksikan akan diuapkan pada suhu 250^oC dalam injektor dan masuk ke dalam kolom (Yuliati dkk, 2012).

d.    Jenis kolom: jenis kolom yang digunakan yaitu kolom kapiler DB-17 yang merupakan kolom dengan fase stasioner (fase diam) fenil 50%-metilpolisiloksan 50% yang bersifat semi polar dan dapat dioperasikan pada range suhu 40-280/300^oC (Agilent, 2017).

e.    Gas pembawa (carrier gas): Gas pembawa harus sangat murni atau Ultra High Purity (UHP) dan dialirkan dengan kecepatan tertentu. Semakin cepat aliran maka kecepatan migrasi solut semakin cepat. Gas pembawa yang digunakan adalah jenis N₂ dengan kecepatan alir 1,5 mL/menit dan hidrogen sebagai gas pendorong dengan kecepatan alir 60 mL/menit (Li et al., 2015).

f.      Ketebalan fase stasioner: Semakin tebal fase stasioner maka resolusi dua komponen yang terelusi secara berurutan juga meningkat. Fase stasioner yang tebal akan meretensi komponen lebih lama dan memerlukan suhu yang lebih tinggi untuk mengelusi komponen pada nilai k’ yang sama. Pada penelitian ini ketebalan fase stasioner yaitu 0,25 mm (ketebalan standar) dan sesuai untuk pemisahan solut yang terleusi hingga suhu 300^oC (Saraiva et al., 2011).

g.    Panjang kolom: semakin panjang kolom maka pemisahan solut pada sampel semakin baik. Hal ini karena resolusi kolom akan meningkat seiring dengan semakin panjang kolom (Li et al., 2015).

h.    Suhu kolom dan Gradien suhu: Semakin tinggi suhu kolom maka interaksi solut dengan fase stasioner semakin lemah. Karena itu adanya gradien suhu bertujuan agar peak yang terbentuk berdekatan (range waktu munculnya peak tidak terlalu jauh) akibat interaksi solut dengan fase stasioner yang melemah seiring meningkatnya suhu (Yuliati dkk, 2012).

i.      Detekor: detektor yang digunakan yaitu FID yang merupakan detektor general untuk mengukur solut sampel yang memiliki gugus alkil (C-H). Gas pembakar yang digunakan yaitu campuran udara dan H₂. Selain itu, FID merupakan detektor yang sesuai dengan gas N₂ yang merupakan gas pembawa. Batas deteksi minimum (BDM) yang disepakati adalah sebesar 10^-12. Asam glukuronat terdapat dalam jumlah kurang dari 10^-12 di dalam sampel sehingga tidak terdeteksi detektor (Li et al., 2015).

4.    Referensi

Jurnal Utama

Wang, X., Zhang, L., Wu, J., Xu, W., Wang, X., Lü, X. (2017). Improvement of Simultaneous Determination of Neutral Monosaccharides and Uronic Acids by Gas Chromatography. Food Chemistry 220 (2017) 198–207.

Literatur Pendukung

Agilent. (2017). DB-17 Column. Diakses melalui http://www.agilent.com pada 25 November 2017.

Huang, Y., Li, N., Wan, J.-B., Zhang, D., & Yan, C. (2015). Structural Characterization and Antioxidant Activity of A Novel Heteropolysaccharide from The Submerged Fermentation Mycelia of Ganoderma capense. Carbohydrate Polymers, 134, 752–760.

Li, W.-Y., Li, P., Li, X.-Q., Huang, H., Yan, H., Zhang, Y., et al. (2015). Simultaneous Quantification of Uronic Acid, Amino Sugar, and Neutral Sugar In The Acidic Polysaccharides Extracted from The Roots of Angelica sinensis (Oliv.) Diels by HPLC. Food Analytical Methods, 8(8), 2087–2093.

Mao, G.-H., Ren, Y., Feng, W.-W., Li, Q., Wu, H.-Y., Jin, D. (2015). Antitumor and Immunomodulatory Activity of A Water-Soluble Polysaccharide from Grifola frondosa. Carbohydrate Polymers, 134, 406–412.

PubChem. (2017). D-Galacturonic Acid. Diakses melalui https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov pada 25 November 2017.

Saraiva, D., Semedo, R., Castilho, Mda C, Silva, J.M., Ramos, F. (2011). Selection of The Derivatization Reagent-The Case of Human Blood Cholesterol, Its Precursors and Phytosterols GC-MS analyses. J Chromatogr B. 879:3806-11.

Yang, L., and Zhang, L.-M. (2009). Chemical Structural and Chain Conformational Characterization of Some Bioactive Polysaccharides Isolated from Natural Sources. Carbohydrate Polymers, 76(3), 349–361.

Yuliati, W., M. Ilyah, K. Indirawati. (2012). Analisa Kinerja Gas Chromatography Tipe Shimadzu GC-FID 2010 Pada Pengaruh Perubahan Temperature Column Terhadap Nilai Retention Time dan Area of Detection Peak dari Bhypenile in N-Hexane di PT. Ditek Jaya (SHIMADZU Analytical and Scientific Corp.). Jurnal Teknik Fisika Vol. 1, No. 1, (2012) 1-5.

Zhang, Z., Khan, N. M., Nunez, K. M., Chess, E. K., and Szabo, C. M. (2012). Complete Monosaccharide Analysis by High-Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection. Analytical Chemistry, 84 (9), 4104–4110.