REVIEW JURNAL 2’-Fucosyllactose

Enhanced Production of 2’-Fucosyllactose in Engineered

Escherichia coli BL21star(DE3) By Modulation of Lactose Metabolism

and Fucosyltransferase

1.   Latar Belakang

Susu manusia memiliki kandungan oligosakarida unik yaitu 2’-fucosyllactose (2-FL) yang memiliki banyak manfaat sebagai prebiotik, mencegah infeksi patogen, dan memodulasi sistem imun (Bode, 2012). Biosintesis 2-FL dengan memanfaatkan mikroba lebih unggul karena dapat menghasilkan yield dalam jumlah besar dengan proses yang mudah, dibandingkan secara kimia atau fermentasi (Han et al., 2012). Mikroba yang digunakan selama ini hanya dari jenis E. coli JM107 (DE3) dan E. coli JM109 (DE3) dikarenakan strain ini mampu mengambil laktosa namun tidak memetabolismenya (Lee et al., 2012).

Produksi 2-FL di mikroba dipengaruhi oleh banyak faktor yang hingga saat ini menjadi kendala, yaitu ekspresi α-1,2-fucosyltransferase (FucT2) terlarut yang berperan untuk mengkatalisis pemindahan molekul l-fucose dari GDP-lfucose ke akseptor seperti laktosa sangat rendah sehingga mempersulit kuantifikasi FucT2 (Lee et al., 2012). Solusi untuk mengatasinya yaitu menggunakan pelabelan asam amino aspartat yang untuk meningkatkan ekspresi FucT2 dan produksi 2-FL.

Faktor lain yang mempengaruhi yaitu E. coli strain JM memiliki kelemahan karena membentuk biofilm dan mengakumulasi asetat. Kedua hal ini mengakibatkan masalah selama fermentasi, purifikasi, dan filtrasi (Bode, 2012). Karena itu strain yang digunakan diganti menjadi E.coli strain BL21 karena strain ini tidak memiliki episom F’ sehingga pertumbuhannya cepat, akumulasi asetat yang lebih rendah, dan penggunaan glukosa yang lebih baik. Selain itu strain BL21 tahan terhadap stres sehingga dapat memproduksi protein heterolog dalam jumlah besar. Fenotipe ini diduga karena adanya delesi lac operon di kromosom dan penggantian dengan episom F’ yang berisi lac operon termodifikasi (lacIq lacZΔM15) (Baumgärtner et al., 2013).

Pada penelitian sebelumnya, telah diproduksi 2-FL menggunakan E. coli BL21star (DE3) namun hanya sedikit 2-FL yang diproduksi karena E. coli BL21star(DE3) lebih banyak mencerna laktosa daripada mengkonversinya menjadi 2-FL (Lee et al., 2012). Pada penelitian ini, dianalisa efek modulasi E. coli BL21star(DE3) dengan substitusi lac operon termodifikasi (lacIq lacZΔM15) untuk meningkatkan produksi 2-FL dalam kondisi fermentasi batch.

2.   Proses Produksi 2-FL Alami di Mikroba

Gambar 1. Metabolic pathway biosintesis 2-FL E. coli

Berdasarkan berbagai penelitian sebelumnya ditunjukkan bahwa E. coli BL21star(DE3) yang lacZ nya dihapus, tidak dapat memproduksi 2-FL. Selain itu, mutasi polar pada lacZ mengarah pada penurunan kemampuan sintesis permease laktosa (LacY) dan tiogalaktosida transasetilase (LacA). Hal ini menunjukkan bahwa transport laktosa ke sel dipengaruhi oleh lacZ.

3.   Modifikasi yang Dilakukan

Gambar 2. Skema pembuatan E. coli strains (a) BL21star(DE3); (b) L; (c) L M15

Gambar 2 menunjukkan skema penghapusan lac operon endogen dan substitusi lac operon baru ke E. Coli BL21star(DE3). Langkah pertama, lac operon endogen dihapus oleh rekombinasi λ–red, sehingga dihasilkan E. coli strain ΔL (strain yang kehilangan lac operon). Pada langkah kedua, fragmen lac operon baru yang berisi lacZΔM15 disubstitusi ke sisi gen glmS oleh Tn7 sehingga dihasilkan ΔL M15 strain (lacZΔM15 knock-in strain).

Plasmid BCGW dibuat untuk mengekspresikan gen untuk enzim biosintetik GDP-L-fucose (ManB, ManC, Gmd and WcaG), dan plasmid F dibuat untuk mengekspresikan FucT2 dari H. pylori (Lee et al., 2009). Untuk amplifikasi aspartat yang menempel pada gen FucT2, primer DNA diformulasi oleh primer forward dan R KpnI FucT2. Contohnya, D3-FucT2 (FucT2 dengan ujung N tiga aspartat yang menempel) diamplifikasi menggunakan F NdeI D3-FucT2 and R KpnI FucT2.

4. Hasilnya Dibandingkan dengan Kontrol

4.1 Efek Modulasi Lac Operon Terhadap Produksi 2-FL

Strain E.coli	Modifikasi	Konsumsi Laktosa	Produksi 2-FL	Yield laktosa	Keterangan
BL21star (DE3)	wild type	Ya, untuk pertumbuhan sel	0.51 g/L	0.025 g 2- FL/g lactose	Kontrol
ΔL	Kehilangan lac operon	Tidak	Tidak	-	Tidak menghasilkan karena hilangnya lactose permease
ΔL M15	knock-in strain	Ya, 1.8 g/l laktosa	0.16 g/L 2-FL	0.091 g 2-FL/g	Tiga kali lipat 2-FL dibanding kontrol

4.2 Efek Penempelan Aspartat pada FucT2 Terhadap Produksi 2-FL

Asam amino sederhana seperti aspartat (Asp, D) diketahui mempengaruhi ekspresi gen heterolog pada E.coli (Kim et al., 2015). Efek FucT2s digabungkan dengan 3 hingga 6 label aspartat (D3-D6 tags) pada produksi 2-FL dicari melalui fermentasi batch terhadap 4 strain E.coli ΔL M15 BCGW yang dimodifikasi sehingga bisa mengekspresikan D3-FucT2, D4-FucT2, D5-FucT2 atau D6-FucT2, berturut-turut. Berdasarkan gambar 3a, ekspresi D4-FucT2, D5-FucT2, dan D6-FucT2 tidak dapat dikonfirmasi. Sebagian besar FucT2 diekspresikan sebagai bentuk tidak terlarut pada E.coli. Tingkat ekspresi FucT2 total dan tidak terlarut menurun signifikan pada strain D3-FucT2.

Gambar 3. Hasil analisa SDS-PAGE pada (a) ekstrak kasar dan (b) enzim yang telah dipurifikasi untuk mengetahui pengaruh pelabelan aspartat terhadap pola ekspresi FucT2 pada beberapa varian E.coli (singkatan: T; total fraksi protein, S; fraksi protein terlarut, I; fraksi protein tidak terlarut, M; berat molekul marker)

Pada gambar 3b, dilakukan analisa SDS-PAGE pada FucT2 and D3-FucT2 yang telah dipurifikasi untuk mengkonfirmasi ekspresi tingkat kelarutan. Hasilnya menunjukkan bahwa tingkat ekspresi D3-FucT2 lebih tinggi dibandingkan FucT2. Untuk verifikasi aktivitas enzim D3-FucT2 terhadap produksi 2-FL dilakukan uji lanjut. Hasilnya terdapat 10.4 µmol 2-FL yang disintesis oleh D3-FucT2 atau 3.4 kali lebih tinggi dibandingkan FucT2 (gambar 4).

Gambar 4. Analisa HPLC hasil reaksi enzimatis in vitro campuran dengan (a) kontrol, (b) FucT2 dan (c) D3-FucT2

  

4.3 Produksi 2-FL Pada Fed-Batch Fermentation

Gambar 5. Hasil fermentasi batch E. coli strains (a) BL21star(DE3) BCGWF (kontrol); (b) ΔL BCGW-F; (c) ΔL M15 BCGW-F.

Berdasarkan gambar 5, strain ΔL M15 atau ΔL M15 BCGW-F menghasilkan 2.6 g/L of 2-FL dengan yield 0.063 g 2-FL/g laktosa pada akhir fermentasi batch. Konsentrasi intraseluler 2-FL kira-kira 10% (<0.4 g/L) dari total 2-FL. Walaupun strain kontrol memproduksi 2-FL lebih dari strain ΔL M15, ΔL M15 dianggap lebih efisien karena yield 2-FL meningkat 3 kali lipatnya. Pengaruh pelabelan aspartat pada FucT2 sebanyak 3-6 menunjukkan bahwa konsentrasi 2-FL meningkat secara linear hingga 6.4 g/L dalam kultur dengan yield laktosa 0.225 g/g, atau 2.5 dan 3.6 kali lipat lebih tinggi daripada strain kontrol. Peningkatan availabilitas laktosa intraseluler dapat ditingkatkan dengan mereduksi aktivitas β-galaktosidase secara signifikan dengan tetap mempertahankan aktivitas lacY dan lacA.

5.   Kesimpulan

Upaya peningkatan efisiensi produksi 2-FL berbasis mikroba tanpa ada pembentukan biofilm yaitu dengan cara penggunaan E. coli BL21star(DE3). Metabolisme laktosa endogen oleh E.coli dimodulasi oleh pemindahan lac operon endogen dengan modifikasi lac operon berisi lacZΔM15 untuk meningkatkan availabilitas laktosa intraseluler. Sebagai tambahan, digunakan fusi aspartat pada FucT2 meningkatkan produksi 2-FL.

REFERENSI

Jurnal utama

Chin, Y. W., J.Y. Kim, W.H. Lee, J.H. Seo. 2015. Enhanced Production of 2-Fucosyllactose in Engineered Escherichia coli BL21star(DE3) by Modulation of Lactose Metabolism and Fucosyltransferase. Journal of Biotechnology 210 (2015) 107–115.

Jurnal pendukung

Bode, L. 2012. Human Milk Oligosaccharides: Every Baby Needs A Sugar Mama. Glycobiology 22, 1147–1162

Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G.A., Albermann, C. 2013. Construction of E. coli Strains With Chromosomally Integrated Expression Cassettes for The Synthesis of 2’-fucosyllactose. Microb. Cell Fac. 12, 40

Han, N.S., Kim, T.J., Park, Y.C., Kim, J., Seo, J.H., 2012. Biotechnological Production of Human Milk Oligosaccharides. Biotechnol. Adv. 30, 1268–1278.

Kim, S.K., Park, Y.C., Lee, H.H., Jeon, S.T., Min, W.K., Seo, J.H. 2015. Simple Amino Acid Tags Improve Both Expression and Secretion of Candida antarctica lipase B in recombinant E. coli. Biotechnol. Bioeng. 112 (2), 346–355

Lee, W.H., Pathanibul, P., Quarterman, J., Jo, J.H., Han, N.S., Miller, M.J., Jin, Y.S., Seo, J.H., 2012. Whole Cell Biosynthesis of A Functional Oligosaccharide, 2’-fucosyllactose, Using Engineered E. coli. Microb. Cell Fac. 11, 48

Lee, W.H., Han, N.S., Park, Y.C., Seo, J.H. 2009. Modulation of Guanosine 5’-Diphosphate-D-Mannose Metabolism in Recombinant E. coli for Production of Guanosine 5’-diphosphate-l-fucose. Bioresource Technol. 100, 6143–6148