ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

PENDAHULUAN

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) adalah suatu teknik biokimia yang khusus digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. Prinsip dasar ELISA adalah reaksi antara antigen (Ag) dengan antibodi (Ab) menjadi molekul Ag-Ab yang lebih besar dan mudah mengendap. Pengamatan ELISA  berdasarkan perubahan warna yang terjadi akibat hidrolisa enzimatik antara konjugat Ab-enzim dengan substratnya (Sitepu, 2012). Saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, konjugat antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat dikuantifikasi berdasarkan intensitas fluoresensi menggunakan spektrofotometer (Hadi, 2014). Teknik ini sering digunakan karena bersifat sensitif, spesifik, efektif dan efisien untuk menguji sampel dalam jumlah besar. Selain itu juga terbilang murah dan cukup mudah pengerjaannya (Sitepu, 2012).

Menurut Suryadi dkk., (2009), komponen-komponen instrumental ELISA adalah sebagai berikut :

a.    Antibodi.

Antibodi adalah immunoglobulin (Ig) dari organisme yang diimunisasi antigen patogen sasaran (AgP). Berdasarkan teknik produksi dan spesifisitas reaksinya, antibodi dibedakan menjadi antibodi poliklonal (PAb) dan antibodi monoklonal (MAb). Antibodi juga dibedakan menjadi antibodi primer (Ab) dan antibodi sekunder (AB). Ab adalah antibodi homolog yang bereaksi dengan AgP, diproduksi dengan mengimunisasi hewan seperti mencit dan kelinci dengan AgP. Sedangkan AB atau anti-Ab adalah antibodi yang diproduksi dengan mengimunisasi hewan lain seperti kambing dengan Ab.

b.    Antigen

Antigen adalah protein yang digunakan sebagai AgP pada teknik ELISA seperti partikel virus, sel bakteri, propagul jamur, atau senyawa protein dan polisakarida patogen yang antigenik, dapat merangsang timbulnya Ab pada hewan yang diimunisasi. AgP digunakan sebagai kontrol positif pada uji ELISA.

c.    Imunoprob

Imunoprob adalah antibodi yang terkonjugasi dengan suatu enzim menjadi konjugat Ab-enzim. Konjugat ini dapat dibuat dengan mengkonjugasikan Ab atau AB dengan enzim tertentu. Enzim yang digunakan untuk membuat konjugat beragam jenisnya, yang paling umum adalah Alkaline Phosphatase (AP) dan Horseradish Peroxidase (HRP).

d.    Substrat

Senyawa kimia yang digunakan sebagai media (substrate) untuk reaksi enzimatik berbeda-beda bergantung pada enzim yang digunakan. Enzim AP memerlukan p-nitrophenyl phosphate (PNPP) yang dilarutkan dalam diethanolamine 10%. Substrat ini dihidrolisis oleh enzim menjadi p-nitrophenyl (PNP) yang berwarna kuning. Enzim HRP menggunakan substrat tetramethyl benzidine (TMB) yang dilarutkan dalam dimethylsulsulfoxide (DMSO) dan menghasilkan produk berwarna biru.

e.    Reagen

Reagen yang diperlukan dalam ELISA adalah bufer, blocking reagent, dan pelarut substrat. Bufer dasar yang paling sering digunakan dalam ELISA adalah bufer fosfat (Phosphate-Buffered Saline, PBS) dan bufer karbonat. Bufer lain seperti bufer ekstraksi, bufer pencuci, bufer Ab, bufer konjugat, dan bufer substrat dibuat dengan menambahkan senyawa kimia tertentu seperti Tween-20, polyvinylpirrolidone (PVP), dan 2-mercaptoethanol pada bufer dasar. Senyawa yang sering digunakan untuk blocking reagents adalah bovine serum albumin (BSA), ovalbumin (OA), gelatin, susu skim, NaOH, dan asam sulfat (H2SO4).

f.     Cawan ELISA

Cawan adalah tempat terjadinya reaksi. Cawan yang biasa digunakan adalah cawan polystyrene yang memiliki sumuran (well) sebanyak 96 buah yang disebut microtiter plate. Cawan lain yang biasa digunakan terbuat dari polyvinyl atau bahan plastik lain. Setiap cawan memiliki kualitas pengikatan Ab (Ab binding capacity) yang bervariasi, sehingga pengguna perlu melakukan uji coba untuk memperoleh hasil optimal.

Seiring dengan majunya teknologi karena kebutuhan manusia, ELISA terbagi menjadi beberapa teknik analisa yang terus mengalami pengembangan. Menurut Sogandi (2014), langkah kunci dari setiap teknik tersebut adalah imobilisasi antigen, yaitu dapat dilakukan dengan adsorpsi langsung ke pelat uji atau tidak langsung melalui antibodi capture yang telah melekat pada plate. Antigen tersebut kemudian dideteksi baik secara langsung (antibodi primer berlabel) maupun tidak langsung (antibodi sekunder berlabel).

Tahapan umum ELISA meliputi proses penempelan antibodi atau antigen (coating plate), pencucian (washing) dengan buffer phosphat saline, penambahan blocked buffer, penambahan antibodi primer, penambahan antibodi sekunder (konjugasi enzim antibodi), penambahan substrat dan kromofor, penambahan larutan penghenti reaksi, serta kuantifikasi intensitas warna menggunakan spektrofotometer/ELISA reader (Sogandi, 2014).

Tabel 1. Simbol-simbol dalam Mekanisme Kerja ELISA

Simbol	Deskripsi
I	Fase padat berupa microtiter well
Ag	Antigen
Ab	Antibodi primer
AB	Antibodi sekunder
AntiAb	Anti spesies antibodi primer
AntiAB	Anti species antibodi sekunder
**Enz	Enzim yang terikat pada reaktan (antibodi)
S/C	Substrat/ kromofor
–	Pengikatan pada fase padat melalui absorpsi pasif
+	Penambahan reagen

METODE ELISA

ELISA terbagi menjadi beberapa teknik analisa, yaitu Direct, Indirect, Sandwich,, Competitive serta Biotin Streptovidin.

1. Direct ELISA

Direct ELISA (ELISA langsung) merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan  mengukur konsentrasi antigen pada sampel. Antigen yang akan dideteksi akan berikatan langsung (direct) dengan antibodi detector (antibody yang telah dilabeli oleh enzim). Antibodi yang digunakan pada teknik direct ELISA berjumlah satu buah (Nugroho dan Dwi, 2016).

Kelebihan direct ELISA :

·       pengujian cepat karena hanya menggunakan satu jenis antibodi

·       kemungkinan terjadinya kegagalan akibat reaksi silang dengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapat diminimalisasi

Kekurangan direct ELISA :

·      amplifikasi signal hanya sedikit

·      immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim

·      tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) pada percobaan yang berbeda

Mekanisme kerja direct ELISA (Modifikasi Crowther, 2000):

	1.    Antigen dilarutkan pada buffer karbonat/ bikarbonat (pH 9.4) atau buffer fosfat salin (pH 7.4). Syarat buffer aalah tidak mengandung protein lain yang dapat mengganggu terikatnya antigen pada fase padat. Antigen dalam buffer kemudian dimasukkan ke dalam well kemudian diinkubasi pada suhu 37⁰C selama semalam. 2.    Selama masa inkubasi antigen ini akan teradsorpsi (terikat) pada fase padat secara pasif. Selanjutnya dilakukan pencucian untuk membuang partikel-partikel antigen yang tidak terikat pada fase padat.
	3.    Antibodi terlabel enzim (konjugat) dilarutkan pada blocking buffer. Blocking buffer berfungsi untuk meningkatkan sensitivitas assay dengan mengurangi sinyal-sinyal pengganggu. 4.    Antibodi terlabel tersebut ditambahkan ke dalam well sehingga akan terbentuk ikatan kompleks antara fase padat, antigen dan antibodi terlabel. Setelah itu dilakukan pencucian untuk membuang partikel konjugat bebas.
	5.    Substrat/  kromofor ditambahkan ke dalam well. Hal ini bertujuan untuk memicu reaksi pengembangan warna melalui reaksi katalis enzim. Reaksi tersebut dibiarkan berjalan selama selang waktu tertentu hingga tercapai intensitas warna yang diinginkan. 6.    Reaksi dihentikan dengan cara mengubah pH lingkungan menggunakan larutan penghenti atau stopping reagent. Selanjutnya intensitas warna yang terbentuk dapat dikuantifikasi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang tertentu.

2. Indirect ELISA

Indirect ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi antigen atau antibodi. Teknik tersebut memiliki karakteristik yaitu antigen tidak menempel langsung pada antibodi detector (inderect). Antigen akan berikatan dengan antibodi lain terlebih dahulu. Antibodi tersebut kemudian makan berikatan dengan antibodi yang telah dilabeli (Nugroho dan Dwi, 2016).

Kelebihan indirect ELISA :

·      antibodi sekunder mudah diperoleh karena dijual bebas

·      immunoreaktivitas antibodi primer tidak terpengaruh oleh tautan enzim pada antibodi sekunder karena dilakukan pada wadah berbeda

·      tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi primer memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder

Kekurangan indirect ELISA :

·      pengujian yang relatif lebih lama karena menggunakan 2 jenis antibodi sehingga membutuhkan waktu dua kali inkubasi

·      Antigen dari sampel harus dimurnikan

Mekanisme kerja indirect ELISA (Modifikasi Crowther, 2000)

	1.    Antigen ditambahkan ke dalam well kemudian diinkubasi pada suhu 37oC. Selanjutnya dilakukan pencucian untuk membuang antigen yang tidak terikat pada fase padat. Pencucian dilakukan dengan cara mengisi dan mengosongkan well menggunakan buffer sebanyak 3-4 kali.
	2.    Antibodi primer ditambahkan dan diinkubasi sehingga akan terikat pada antigen dan fase padat. Antibodi yang bergerak bebas tanpa ikatan dibuang melalui pencucian menggunakan buffer sebanyak 3-4 kali.
	3.    Antispesies dari antibodi sekunder yang telah terlabel enzim dilarutkan dalam blocking buffer kemudian ditambahkan ke dalam well dan diinkubasi. 4.    Selama inkubasi akan terjadi pengikatan antara antibodi primer dengan antispesies dari antibodi sekunder yang terlabel enzim. Selanjutnya well dicuci menggunakan buffer sebanyak 3-4 kali bilas.
	5.    Substrat/ kromofor ditambahkan ke dalam well dan diinkubasi hingga tercapai intensitas warna yang diinginkan. 6.    Reaksi dapat dihentikan dengan cara mengubah pH lingkungan menggunakan larutan penghenti. Selanjutnya intensitas warna yang terbentuk dapat dikuantifikasi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang tertentu.

3.    Sandwich ELISA

Bentuk sandwich ini berasal dari posisi antigen yang berada diantara dua antibodi yakni antibodi yang tertempel pada fase padat (biasa disebut capture antibody) dan antibodi yang yang terkonjugasi dengan enzim (detecting antibody/detector). Sistem sanchwich ini bervariasi tergantung pada sumber antibodi yang digunakan. Sanwich ELISA dibagi menjadi dua yakni Sandwich Direct dan Sandwich Indirect (Crowther, 2000). Berikut adalah perbedaan antara keduanya:

Tabel 2. Perbedaan Sandwich Direct dan Indirect

No.	Sandwich Direct	Sandwich Indirect
1. 2.	Mendeteksi antibodi yang terlabel Capture antibody dan detecting antibody dapat berasal dari sampel yang sama	Mendeteksi antibodi yang tidak terlabel Capture antibody dan detecting antibody berasal dari sampel yang berbeda

Keuntungan Sandwich ELISA antara lain memiliki spesifitas yang tinggi dan cocok untuk jenis sampel yang berupa campuran/tidak murni karena antigen yang digunakan tidak perlu dimurnikan (Nugraha dan Dwi, 2016)

Mekanisme kerja Sandwich ELISA :

a.  Sandwich Direct ELISA (Modifikasi Crowther, 2000)

1.    Antibodi ditempelkan pada fase padat dengan menginkubasinya pada buffer, kemudian dilakukan pencucian untuk menghilangkan antibodi yang bebas.

2.    Antigen ditambahkan, antigen akan berikatan dengan antibodi yang telah terikat pada fase padat selama proses inkubasi. Antigen yang bebas selanjutnya dihilangkan dengan pencucian.

3.     Konjugat antibodi (antibodi yang berikatan dengan enzim) ditambahkan, antibody ini dapat disiapkan dari sumber yang sama dengan antibody yang tertempel pada fase padat ataupun dari sumber (spesies) yang berbeda. Ikatan yang terbentuk dengan konjugat antibodi selama inkubasi akan membentuk tumpukan seperti sandwich.  Konjugat antibodi yang bebas selanjutnya dihilangkan dengan pencucian

4.    Substrat/kromofor ditambahkan dan diinkubasi selama waktu tertentu. Maka akan ada perubahan warna yang terjadi. 5.    Reaksi kemudian dihentikan dengan penambahan stopping reagent, dan dilanjutkan dengan pengukuran secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer

  

b. Sandwich Indirect ELISA (Modifikasi Crowther, 2000)

1.    Antibodi ditempelkan pada fase padat dengan menginkubasinya pada buffer, kemudian dilakukan pencucian untuk menghilangkan antibodi yang bebas.

2.    Antigen ditambahkan, antigen akan berikatan dengan antibodi yang telah terikat pada fase padat selama proses inkubasi. Antigen yang bebas selanjutnya dihilangkan dengan pencucian.

3.    Antibodi sekunder yang melawan antigen ditambahkan. Antibodi ini berasal dari spesies yang berbeda dengan antibodi primer (yang terikat dengan fase solid) dan dilarutkan pada bloking buffer (larutan yang digunakan untuk mengurangi sinyal pengganggu). Selama inkubasi akan terbentuk ikatan bertumpuk seperti sandwich. Sisa dari antibodi yang tidak berikatan selanjutnya dihilangkan dengan cara dicuci.

4.    Antispesies konjugat (antispesies antiserum dari antibodi sekunder) ditambahkan. Selama proses inkubasi akan terbentuk ikatan konjugat, setelah itu dilakukan pencucian untuk menghilangkan konjugat yang tidak terikat.

5.    Substrat/kromofor ditambahkan dan diinkubasi selama waktu tertentu. Maka akan ada perubahan warna yang terjadi. 6.    Reaksi kemudian dihentikan dengan penambahan stopping reagent, dan dilanjutkan dengan pengukuran secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer

4.    Competitive ELISA

ELISA kompetitif atau ELISA pemblok dapat digunakan untuk mengukur antibodi maupun antigen (Crowther, 2000). Prinsip dasar dari teknik ELISA kompetitif adalah dengan menambahkan suatu kompetitor ke dalam lubang microtiter/well (Sitepu, 2012). ELISA dapat dilakukan secara kompetitif langsung (direct competitive) dan kompetitif tak langsung (indirect competitive) ELISA.

Kelebihan dari competitive ELISA adalah  tidak diperlukan purifikasi pada sampel yng mengandung antibody/antigen, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesifisitas dari antibodi dan antigen.

a.    Competitive Direct ELISA

ü C-direct ELISA untuk pengujian konsentrasi antigen

Pada pengujian ini digunakan antigen yang terlabel enzim dan juga antigen tanpa terlabel enzim. Keduanya akan berkompetisi untuk berikatan dengan antibodi yang sebelumnya telah menempel pada fase padat. Semakin tinggi konsentrasi antigen pada sampel maka semakin sedikit antigen yang terlabel enzim dapat menempel pada antibodi (Sitepu, 2012).

Mekanisme kerjanya adalah sebagai berikut (modifikasi Karen et.al, 2012) :

1.    Penempelan antibodi pada fase padat 2.    Penambahan antigen yang terlabel enzim dan antigen tanpa terlabel enzim. Selama inkubasi akan terjadi kompetisi dari kedua antigen tersebut untuk dapat menempel pada antibodi. 3.    Terjadi ikatan antara antigen dan antibodi. Antigen yang tidak terikat dihilangkan dengan pencucian 4.    Substrat dari enzim ditambahkan dan diinkubasi selama waktu tertentu. Setelah itu dapat diukur aktifitas enzim melalui perubahan warna yang terjadi.

Nilai aktifitas enzim berbanding terbalik dengan konsentrasi antigen. Dengan menggunakan grafik dibawah ini, maka akan dapat menentukan konsentrasi dari antigen yang sebelumnya tidak ketahui.

ü C-direct ELISA untuk pengujian level antibodi

Pada pengujian ini dibutuhkan antibodi yang terlabel enzim dan juga antibodi tanpa terlabel enzim. Keduanya akan bersaing untuk dapat menempel pada antigen yang sebelumnya telah menempel pada fase padat. Tujuan dari pengujian ini adalah mengukur level dari antibodi spesifik pada sampel. Sama seperti pada pengujian konsentrasi antigen, jumlah produk yang terbentuk berbanding terbalik dengan level antibodi (Karen et.al, 2012).

Mekanisme kerjanya adalah sebagai berikut (modifikasi Karen et.al, 2012) :

1.    Penempelan antigen pada fase padat

2.    Penambahan antibodi yang terlabel enzim dan antibodi tanpa terlabel enzim. Selama inkubasi akan terjadi kompetisi dari kedua antigen tersebut untuk dapat menempel pada antigen

3.    Terjadi ikatan antara antigen dan antibodi. Antibodi yang tidak terikat akan dihilangkan dengan pencucian

4.    Substrat dari enzim ditambahkan dan diinkubasi selama waktu tertentu. Akan terjadi perubahan warna pada produk yang terbentuk. Banyaknya warna yang terbentuk berbanding tetbalik dengan level dari antibodi sampel

b.    Competitive Indirect ELISA

Pengujian ini didasarkan pada kompetisi antara antigen bebas dari sampel dan antigen yang telah tertempel pada permukaan fase padat untuk dapat berikatan dengan antibodi yang terbatas (Bang et.al., 2012).

Tahap-tahapannya adalah sebagai berikut (modifikasi Karen et.al, 2012 ) :

1.    Penempelan antigen pada fase padat

2.    Penambahan antigen bebas dari sampel dan antibodi. Selama inkubasi akan ada kompetisi antara antigen bebas dari sampel dan antigen yang tertempel pada fase padat.

3.    Akan terbentuk ikatan antigen-antibodi.

4.    Selanjutnya dilakukan pencucian untuk menghilangkan antigen bebas dan juga ikatan antibodi-antigen bebas yang terbentuk.

5.    Penambahan antibodi sekunder yang terlabel enzim, sehingga akan menempel pada antibodi pertama.

6.    Substrat dari enzim ditambahkan dan diinkubasi selama waktu tertentu. Akan terjadi perubahan warna pada produk yang terbentuk. Banyaknya warna yang terbentuk berbanding tetbalik dengan konsentrasi antigen sampel

5.    Biotin Streptovidin

Semakin berkembangnya teknologi, teknik ELISA pun semakin mengalami perkembangan untuk mendeteksi antibodi dengan tingkat sensitivitas yang relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibodi, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich indirect. Teknik ini biasa digunakan untuk mendeteksi biotin yang bertaut dengan suatu antibodi streptavidin (Teuscher, 2014).

Mekanisme kerjanya adalah sebagai berikut (Teuscher, 2014) :

1.     Antibodi primer atau capture antibody yang telah dilarutkan dalam buffer dimasukkan ke dalam wells sehingga akan terikat pada fase padat setelah inkubasi. Selanjutnya dilakukan pencucian untuk menghilangkan antibodi yang bebas

2.    Antibodi primer akan menangkap (capture) protein target berupa antigen yang ditambahkan ke dalam well sehingga akan terbentuk ikatan antara antibodi dan antigen. Antigen yang bebas selanjutnya dihilangkan dengan pencucian.

3.     Antibodi sekunder atau detection antibody yang terkonjugasi dengan biotin  dilarutkan dalam blocking buffer lalu ditambahkan ke dalam well dan diinkubasi. Selanjutnya akan terbentuk ikatan kompleks yang menyerupai tumpukan sandwich. Konjugat antibodi sekunder yang keberadaannya dalam bentuk bebas dihilangkan dengan pencucian.

4.    Protein streptavidin yang terkonjugasi dengan enzim horse radish peroxidase (HRP) ditambahkan ke dalam well, sehingga akan membentuk ikatan dengan biotin.

5.    Substrat/ kromofor berupa TMB (tetramethylbenzidine) substrat dari enzim HRP ditambahkan sehingga terjadi reaksi katalis dan menghasilkan produk yang berwarna. Reaksi dihentikan menggunakan larutan penghenti atau stopping buffer ketika telah dicapai intensitas warna yang diinginkan. Intensitas warna dapat dilihat dengan mata telanjang serta dapat diukur absorbansinya me nggunakan spektrofotometer.

DAFTAR PUSTAKA

Bang, J., Shruti S., Young H., Miunghee K. 2012. Development of Indirect Competitive ELISA for Detection of Salmonella typhimurium. Romanian Biotechnological Letters 17 (2): 7194-7204

Crowther, J.R. 2000. ELISA Principles. Guidebook 2nd. Humana Press

Hadi, A. 2014. Teknik Elisa Pemeriksaan Kuantitatif Mannan Binding Lectin (MBL) pada Plasma Darah. Laporan Praktikum. Program Magister Biomedik Universitas Sumatra Utara.

Karen, L.,Viswanath D., Aidas K., Joseph M., Chahrzad M., Sitta S. 2012. Immunoassay Method. USA:National Center for Advancing Translational Sciences.

Nugraha, E., dan Dwi A. 2016. Penuntun Praktikum Bioteknologi. Yogakarta : CV. Budi Utama.

Sitepu, S. 2012. Profil Metabolit Hormon Estrogen dan Progesteron Feses selama Kebuntingan serta Pola Kelahiran Rusa Sambar (Cervus unicolor). Tesis. Universitas Sumatra Utara.

Sogandi. 2014. Teknik Penelitian Biokimia. Makalah. Program Studi Biokimia Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Teuscher, N. 2014. Ligand Binding Assay. Article Science of Pharmacometric Solutions. Certara USA Inc.