III. METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada Bulan Februari hingga
Bulan Juli 2016 di Laboratorium Kimia dan Biokimia, Laboratorium Teknologi
Pengolahan Pangan, dan Laboratorium Bioteknologi, Jurusan Teknologi Hasil
Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya.
3.2 Alat dan Bahan
Alat
yang digunakan dalam penelitian meliputi Juice Cane Extractor (Tagawa), oven, laminar air flow, rotary vacuum evaporator, mortar, neraca
analitik ketelitian 0,1 mg (Mettle denver AA 200), ayakan 60 mesh (W.S. Tyler),
blender kering (Quantum), kulkas (Toshiba), mikropipet nonfixed 1000
μl (finnpipette labsystem), inkubator (WTB Binder),
spektrofotometer (Unico uv-210), autoklaf (HL-36 AE Hiramaya), pH meter
(Hanna), colony counter, jangka
sorong, penggaris, mikrotip, termometer air (Various), spatula kaca (Strepilan),
tabung reaksi (Pyrex Iwaki), gelas beker ukuran 250 ml (Pyrex Iwaki), kompor,
bunsen, rak tabung reaksi, bulb, erlenmeyer ukuran 500 mL (Pyrex Iwaki), labu
gojog 100 ml (Pyrex Iwaki), labu ukur 100 ml (Pyrex Iwaki), cawan petri
(Strepilan), borer 6 mm, cotton swab, alumunium
foil, kapas, korek api, kertas payung, plastik untuk sterilisasi, karet
gelang, dan plastik wrapping.
Bahan yang
digunakan adalah daun gambir varietas cubadak, nira tebu, Potato Dextrose
Agar (PDA), Potato Dextrose
Broth (PDB), Nutrient Broth
(NB) dan Nutrient Agar (NA), aquades, asam galat standar 1000
μg/L, reagen Folin-Ciocalteau (diencerkan 1:10 dengan aquades), larutan Na2CO3
75 g/L, Buffered Peptone Water (BPW), dan alkohol 80%.
3.3 Metode Penelitian
Metode
penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) yang disusun
secara faktorial dengan 2 faktor dan 3 ulangan. Faktor I yaitu metode ekstraksi
daun gambir (M) yang terdiri dari 2 level yaitu metode infus (M1) dan metode maserasi
(M2) dan faktor II adalah konsentrasi ekstrak daun gambir (K) yang terdiri dari
4 level yaitu konsentrasi 70% (K1), 80% (K2), 90% (K3), dan 100% (K4). Analisis
data dilakukan dengan metode Analysis of Varian (ANOVA) untuk mengetahui
apakah ada perbedaan atau pengaruh pada tiap perlakuan. Selanjutnya
dilakukan uji lanjut menggunakan metode BNT.
Dari kedua faktor tersebut, dicari faktor
kombinasi perlakuan yang dapat dilihat pada Tabel 3.1 sebagai berikut:
Tabel
3.1 Faktor kombinasi
perlakuan
Metode ekstraksi (M)
|
Konsentrasi ekstrak daun gambir (K)
|
|||
70% (K1)
|
80% (K2)
|
90% (K3)
|
100% (K4)
|
|
Infus (M1)
|
M1K1
|
M1K2
|
M1K3
|
M1K4
|
Maserasi (M2)
|
M2K1
|
M2K2
|
M2K3
|
M2K4
|
Berdasarkan Tabel 3.1 diatas diperoleh delapan
kombinasi perlakuan yang akan digunakan dalam penelitian dengan rincian yang
dapat dilihat dalam Tabel 3.2 berikut:
Tabel 3.2 Kombinasi perlakuan metode ekstraksi
dan konsentrasi ekstrak
No
|
Sampel
|
Perlakuan
|
1
|
M1K1
|
Ekstraksi dengan metode infus konsentrasi ekstrak
70%
|
2
|
M1K2
|
Ekstraksi
dengan metode infus konsentrasi ekstrak 80%
|
3
|
M1K3
|
Ekstraksi dengan metode infus konsentrasi ekstrak
90%
|
4
|
M1K4
|
Ekstraksi
dengan metode infus konsentrasi ekstrak 100%
|
5
|
M2K1
|
Ekstraksi dengan metode maserasi konsentrasi
ekstrak 70%
|
6
|
M2K2
|
Ekstraksi
dengan metode maserasi konsentrasi ekstrak 80%
|
7
|
M2K3
|
Ekstraksi dengan metode maserasi konsentrasi
ekstrak 90%
|
8
|
M2K4
|
Ekstraksi
dengan metode maserasi konsentrasi ekstrak 100%
|
Jumlah ulangan dihitung dengan rumus sebagai berikut:
(n-1) (p-1) ≥ 15
(n-1) (8-1) ≥ 15
7n-7 ≥ 15
7n ≥ 22
n ≥ 3,1 ≈ 3
keterangan:
p : Jumlah perlakuan dalam penelitian.
n : Jumlah perlakuan ulang
(sampel)
berdasarkan hasil perhitungan diatas, jumlah ulangan
penelitian ini yaitu sebanyak tiga kali.
3.4
Variabel
Variabel-variabel dalam
penelitian ini meliputi:
1.
Variabel bebas
Variabel bebas yang
digunakan dalam penelitian ini adalah perlakuan variasi metode ekstraksi dan
variasi konsentrasi ekstrak daun gambir (Uncaria
gambir Roxb.).
2. Variabel
terikat
Variabel terikat dalam
penelitian ini yaitu Kadar Hambat Minimum (KHM), dan Kadar Bunuh Minimum (KBM).
3. Variabel
terkendali
Variabel terkendali dalam
penelitian ini adalah variabel yang diusahakan sama untuk setiap perlakuan diantaranya
daun gambir dan nira tebu yang digunakan, pelarut yang digunakan, suhu
inkubasi, waktu inkubasi, serta media pertumbuhan bakteri dan khamir.
3.5
Pelaksanaan Penelitian
a.
Persiapan
Nira Tebu (Winata, 2013)
Persiapan bahan baku
sebagai sumber isolat merupakan salah satu hal yang penting karena menentukan
keberhasilan penelitian (Haq dan Ali, 2007). Pada penelitian ini bahan baku
sebagai sumber isolat yang digunakan yaitu nira tebu. Sebanyak 1 lonjor tebu ukuran 30 cm yang
telah dipanen disimpan selama 3 hari yang bertujuan agar mikroba yang
diinginkan tumbuh. Selanjutnya tebu dicuci dan dikupas kulitnya. Tebu tersebut
kemudian diperas menggunakan juice cane extractor dan diulang sebanyak tiga kali agar
semua nira terperas keluar. Nira yang diperoleh kemudian disaring dan disimpan
di dalam botol steril sebagai sumber isolat
bakteri uji dan khamir uji yang digunakan dalam penelitian ini.
b. Pembuatan Stok Kultur
1.
Pembuatan
Stok Kultur Bakteri (Diubah dari Winata, 2013)
Pembuatan kultur bakteri yang tepat sangat penting karena
menentukan keberhasilan penelitian (Pratiwi, 2009). Sebanyak 10 ml nira tebu
ditempatkan pada tabung reaksi kemudian diencerkan secara bertingkat
menggunakan Buffered Peptone Water (BPW) hingga
pengenceran 106. Selanjutnya tiga pengenceran terakhir masing-masing
1 ml dan dilakukan plating pada media NA dengan metode pour plate secara
triplo. Setelah agar memadat, dilakukan selama 24 jam pada suhu 37oC.
Koloni bakteri yang tumbuh setelah inkubasi diamati dan diambil 1 ose untuk diremajakan
atau digunakan pada penelitian selanjutnya.
1.
Pembuatan
Stok Kultur Khamir (Diubah dari Winata, 2013)
Pembuatan stok kultur khamir yang diperoleh secara isolasi sangat
menentukan keberhasilan penelitian (Pratiwi, 2009). Sebanyak 10 ml nira tebu
ditempatkan pada tabung reaksi kemudian diencerkan secara bertingkat
menggunakan Buffered Peptone Water (BPW) hingga
pengenceran 106. Selanjutnya tiga pengenceran terakhir masing-masing
1 ml dan dilakukan plating pada media PDA dengan metode pour plate secara
triplo. Setelah agar memadat, dilakukan selama 48 jam pada suhu 37oC.
Koloni khamir yang tumbuh setelah inkubasi diamati dan diambil 1 ose untuk diremajakan
atau digunakan pada penelitian selanjutnya.
a. Pembuatan Serbuk Daun Gambir Cubadak
(Rao et al., 2011)
Pembuatan
serbuk daun gambir melalui dua tahap yaitu pengeringan dan pengecilan ukuran.
Pengeringan bertujuan untuk menginaktivasi enzim polifenol oksidase sehingga
kerusakan fenol dapat diperkecil (Ahmed, 2008). Pengecilan ukuran bertujuan
untuk memperluas kontak antara bahan (serbuk daun gambir) dengan pelarut
sehingga proses ekstraksi polifenol lebih efektif (Almeida et al., 2005).
Sebanyak 1 kg daun segar
dicuci dan dikeringkan dalam oven suhu 60°C selama 4 jam. Daun gambir kering
kemudian dihancurkan dengan blender kering selama 5 menit, ditumbuk menggunakan
mortar agar lebih halus lalu diayak dengan ayakan 60 mesh.
a. Penentuan Rasio Bahan:Pelarut
Penentuan rasio bahan:pelarut sangat penting untuk
memperoleh hasil ekstraksi yang paling optimal. Penentuan rasio ini menggunakan
metode difusi agar secara
sumuran karena metode difusi agar merupakan metode umum yang praktis, cepat
dalam pembacaan hasil, mudah dan murah (Pratiwi, 2009).
1.
Penentuan
Rasio Bahan:Pelarut Metode Infus (Magdalena, 2015)
Penentuan
rasio dilakukan dengan cara mengekstrak bahan:aquades dengan metode infus yaitu
pemanasan bahan dalam penangas air selama 15 menit pada suhu 90OC. Pada
penelitian ini digunakan variasi rasio 1:25 (b/v), 1:35 (b/v), 1:45 (b/v).
Infusa yang diperoleh disaring dua kali dengan dengan kertas saring halus,
ditempatkan pada botol kaca yang telah dilapisi aluminium foil selanjutnya dilakukan analisa
antibakteri dan antifungal ekstrak menggunakan metode difusi Kirby and Bauer
secara triplo.
Pengamatan
terhadap aktivitas penghambatan mikroba dilakukan dengan mengukur zona hambat
yang terbentuk di sekitar sumuran. Zona hambat yang terbentuk diukur
diameternya menggunakan jangka sorong. Adanya daerah bening di sekeliling
sumuran menunjukkan adanya aktivitas antimikroba. Ekstrak yang menunjukkan zona
hambat tertinggi diasumsikan sebagai rasio bahan:pelarut terbaik yang digunakan
untuk penelitian selanjutnya. Luas zona hambat dihitung dengan rumus sebagai
berikut:
Diameter Zona Hambat = Diameter Zona
Bening – Diameter Lubang Sumuran
2.
Penentuan Rasio
Bahan:Pelarut Metode Maserasi (Dewi, 2010)
Penentuan
rasio dilakukan dengan cara mengekstrak bahan:aquades dengan metode maserasi yaitu
merendam simplisia selama 24 jam dengan kecepatan pengadukan 120 rpm pada
temperatur ruang. Pada penelitian pendahuluan ini digunakan variasi rasio 1:5
(b/v), 1:10 (b/v), 1:15 (b/v). Maserat yang diperoleh disaring dua kali dengan
dengan kertas saring halus, ditempatkan pada botol kaca yang telah dilapisi aluminium
foil selanjutnya dilakukan analisa antibakteri dan antifungal ekstrak
menggunakan metode difusi Kirby and Bauer secara triplo.
Pengamatan
terhadap aktivitas penghambatan mikroba dilakukan dengan mengukur zona hambat yang
terbentuk di sekitar sumuran. Zona hambat yang terbentuk diukur diameternya
menggunakan jangka sorong. Adanya daerah bening di sekeliling sumuran
menunjukkan adanya aktivitas antimikroba. Ekstrak yang menunjukkan zona hambat
tertinggi diasumsikan sebagai rasio bahan:pelarut terbaik yang digunakan untuk
penelitian selanjutnya. Luas zona hambat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Diameter Zona Hambat = Diameter Zona
Bening – Diameter Lubang Sumuran
b. Analisa
Total Fenol
Fenol
merupakan salah satu fitokimia yang paling banyak penyebarannya pada tanaman.
Senyawa fenol diketahui sangat berperan terhadap aktivitas antioksidan dan
antimikroba, semakin besar kandungan senyawa fenol maka semakin besar aktivitas
antioksidan dan antimikrobanya. Metode Folin-ciocalteu adalah salah satu
metode termudah untuk mengukur kandungan total fenol. Metode ini berdasarkan
kemampuan reagen Folin-Ciocalteu mengoksidasi gugus hidroksil (OH-) dari
senyawa golongan fenol dan menghasilkan perubahan warna yang diukur pada
absorbansi 765 nm (Folin dan Ciocalteu, 1944).
1. Prosedur
Pembuatan Kurva Standar Asam Galat (Folin dan Ciocalteu, 1944)
Pada
penentuan total fenol dengan metode Folin-Ciocalteu
perlu dibuat suatu kurva standar asam galat. Kurva standar asam galat
menunjukkan korelasi konsentrasi asam galat dengan absorbansinya sehingga
konsentrasi sampel dapat ditentukan dengan menggunakan analisis regresi linier
(Zhu et al., 2012). Asam galat
digunakan sebagai larutan standar karena merupakan salah satu jenis golongan
senyawa fenolik. Pereaksi Folin-Ciocalteu merupakan larutan kompleks ion
polimerik yang dibentuk dari asam fosfomolibdat dan asam
heteropolifosfotungstat. Pereaksi ini terbuat dari air, natrium tungstat,
natrium molibdat, asam fosfat, asam klorida, litium sulfat, dan bromin (Folin
dan Ciocalteu, 1944).
Prosedur pembuatan kurva
standar asam galat diawali dengan pembuatan larutan asam galat stok 1000 μg/ml,
selanjutnya larutan diencerkan hingga diperoleh larutan asam galat 25 μg/ml, 50
μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml dan 400 μg/ml, diambil 1 ml tiap konsentrasi
larutan asam galat, dimasukkan ke tabung reaksi, ditambahkan larutan Na2CO3
75 g/L 4 ml dan reagen Follin-Ciocalteau
(diencerkan 1:10) 5 ml, divortex, diinkubasi 1 jam suhu ruang dalam kondisi
gelap, dipipet 2 ml kedalam kuvet untuk di ukur absorbasi pada panjang
gelombang (λ) 765 nm, dibuat kurva standar asam galat dengan x=konsentrasi
larutan asam galat dan y=absorbansi, dihitung persamaan regresi dan R2.
1. Prosedur
Analisa Total Fenol (Folin dan Ciocalteu, 1944)
Menurut Nazir (2011),
terdapat korelasi positif antara total komponen fenol dengan aktivitas
antimikroba. Semakin tinggi total fenol maka semakin tinggi pula aktivitas
antimikroba yang dihasilkan. Naufalin (2015) juga menjelaskan bahwa penurunan
gugus hidroksil pada senyawa fenolik hasil ekstraksi akan menurunkan toksisitas
senyawa antimikroba.
Analisa
total fenol diawali dengan persiapan sampel infusa dan maserat daun gambir
dengan rasio bahan:pelarut terbaik. Selanjutnya 1 ml sampel yang akan diuji
dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan larutan Na2CO3
75 g/L 4 ml dan reagen Follin-Ciocalteau
diencerkan 1:10) 5 ml, divortex, diinkubasi selama 1 jam di suhu ruang pada
kondisi gelap, diambil 2 ml ekstrak diisikan ke dalam kuvet, diukur absorbansi
pada panjang gelombang (λ) 765 nm, dikalibrasikan dengan kurva standar asam
galat untuk didapatkan total fenol dalam μg GAE/ml dan dihitung total fenol
dalam μg GAE/g dengan persamaan R2 menggunakan rumus sebagai berikut:
C = CGAE x V
G
Keterangan:
C =
kadar total fenol (μg/g)
CGAE = kadar total fenol dalam bentuk ekuivalen asam galat (μg/ml)
V =
volume ekstrak yang dihasilkan (ml)
G =
massa bahan (g)
a. Pembuatan Ekstrak Daun Gambir Cubadak
Ekstraksi
merupakan proses pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu campuran homogen
menggunakan pelarut cair (solvent)
sebagai agen pemisah (separating agent)
(Ana et al., 2009). Teknik ekstraksi
yang tepat berbeda untuk masing-masing bahan. Hal ini dipengaruhi oleh tekstur
kandungan bahan dan jenis senyawa yang ingin didapat (Solomon, 2003). Pada
penelitian ini digunakan dua metode ekstraksi yaitu metode infus dan metode
maserasi.
1. Pembuatan
ekstrak dengan metode Infus (Magdalena,
2015)
Pembuatan
ekstrak gambir dengan metode infus (Lampiran
1) diawali dengan serbuk daun gambir ditimbang 20 gram, dilarutkan dalam
aquades sebanyak 700 ml (perbandingan 1:35) pada erlenmeyer yang sudah ditutup
oleh alumunium foil. Selanjutnya,
erlenmeyer yang berisi larutan simplisia daun gambir diletakkan dalam beker
gelas yang berisi aquades sebanyak 200 mL dan dipanaskan dalam beker gelas
selama 15 menit pada suhu 90OC. Infusa yang diperoleh disaring dua
kali dengan dengan kertas saring halus, ditempatkan pada botol kaca yang telah
dilapisi aluminium foil dan disimpan pada kulkas suhu 4°C. Konsentrasi
infusa 100% didapatkan dengan cara larutan yang telah didapat diuapkan
menggunakan rotary vacuum evaporator
dengan temperatur 60oC selama ±3 jam hingga diperoleh ekstrak
kental. Selanjutnya larutan infusa diencerkan menggunakan aquades steril sesuai
konsentrasi 70%, 80%, 90%, dan 100% sebelum digunakan.
2. Pembuatan
ekstrak dengan metode Maserasi (Istiqomah, 2013)
Pembuatan
ekstrak gambir dengan metode maserasi (Lampiran
1) diawali dengan serbuk daun gambir ditimbang 20 gram, dilarutkan dalam
aquades sebanyak 200 ml (perbandingan 1:10) pada erlenmeyer yang sudah ditutup
oleh alumunium foil dan dilakukan
maserasi selama 24 jam dengan kecepatan 120 rpm pada temperatur ruang. Maserat
yang diperoleh disaring dua kali dengan dengan kertas saring halus, ditempatkan
pada botol kaca yang telah dilapisi aluminium foil dan disimpan pada
kulkas suhu 4°C. Konsentrasi maserat 100% didapatkan dengan cara menguapkan
larutan yang telah didapat menggunakan rotary
vacuum evaporator dengan temperatur 60oC selama ±3 jam hingga
diperoleh ekstrak kental, selanjutnya larutan maserat diencerkan menggunakan
aquades steril sesuai konsentrasi 70%, 80%, 90%, dan 100% sebelum digunakan.
b.
Penentuan
KHM dan KBM
Penentuan KHM
dilakukan dengan metode dilusi cair menggunakan media cair Nutrien Broth
(NB) untuk bakteri dan media Potato
Dextrose Broth (PDB) untuk khamir. Pengukuran absorbansi menggunakan spektrofotometer
sebelum dan sesudah inkubasi dilakukan untuk melihat pertumbuhan bakteri uji
dan khamir uji. Ekstrak yang dilakukan uji penentuan KHM dan KBM adalah ekstrak
daun gambir.
1. Penentuan
KHM secara kualitatif (Dewi, 2010)
Pada
pengujian KHM bakteri, sebanyak 4 ml media NB steril dimasukkan ke dalam
masing-masing tabung reaksi, ditambahkan 0,5 ml ekstrak yang dibuat dengan 8
perlakuan (Lampiran 2) yaitu infusa
konsentrasi 70%, infusa konsentrasi 80%, infusa konsentrasi 90%, infusa
konsentrasi 100%, dan maserat konsentrasi 70%, maserat konsentrasi 80%, maserat
konsentrasi 90%, maserat konsentrasi 100%. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml
suspensi bakteri kedalam media. Tabung reaksi tersebut kemudian diamati
kejernihannya dengan cara dibandingkan pada kontrol positif dan kontrol negatif.
Tabung-tabung reaksi tersebut kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C
dalam inkubator.
Pada
pengujian KHM khamir, sebanyak 4 ml media PDB steril dimasukkan ke dalam
masing-masing tabung reaksi, ditambahkan 0,5 ml ekstrak yang dibuat 8 perlakuan
(Lampiran 2) yaitu infusa
konsentrasi 70%, infusa konsentrasi 80%, infusa konsentrasi 90%, infusa
konsentrasi 100%, dan maserat konsentrasi 70%, maserat konsentrasi 80%, maserat
konsentrasi 90%, maserat konsentrasi 100%. Selanjutnya ke dalam media ini
ditambahkan 0,5 ml suspensi khamir. Tabung reaksi tersebut kemudian diamati
kejernihannya dengan cara dibandingkan pada kontrol positif dan kontrol
negatif. Tabung-tabung reaksi tersebut kemudian diinkubasi selama 48 jam pada
suhu 37°C dalam inkubator.
Setelah
diinkubasi, tabung reaksi divortex dan diamati kejernihannya dengan cara
dibandingkan dengan kontrol negatif dan diamati kekeruhannya dengan cara
dibandingkan dengan kontrol positif. Kejernihan tabung setelah inkubasi
menunjukkan bahwa mikroorganisme dapat dihambat oleh ekstrak didalam tabung. Sampel
dengan konsentrasi terendah yang tetap jernih setelah inkubasi dianggap sebagai
KHM. Sampel yang tetap jernih selanjutnya diambil untuk dilakukan uji KBM.
2. Penentuan
KHM secara kuantitatif (Madigan et al., 2013)
Pada
pengujian KHM bakteri, sebanyak 4 ml media NB steril dimasukkan ke dalam
masing-masing tabung reaksi, ditambahkan 0,5 ml ekstrak yang dibuat dengan 8
perlakuan (Lampiran 2) yaitu infusa
konsentrasi 70%, infusa konsentrasi 80%, infusa konsentrasi 90%, infusa
konsentrasi 100%, dan maserat konsentrasi 70%, maserat konsentrasi 80%, maserat
konsentrasi 90%, maserat konsentrasi 100%. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml
suspensi bakteri kedalam media. Tabung reaksi tersebut kemudian diukur
absorbansi (Optical Density = OD) awalnya menggunakan spektrofotometer (λ =
480 nm). Tabung-tabung
reaksi tersebut kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C dalam
inkubator. Absorbansi bakteri diukur kembali menggunakan spektrofotometer (λ= 480 nm).
Pada
pengujian KHM khamir, sebanyak 4 ml media PDB steril dimasukkan ke dalam
masing-masing tabung reaksi, ditambahkan 0,5 ml ekstrak yang dibuat 8 perlakuan
(Lampiran 2) yaitu infusa konsentrasi 70%, infusa
konsentrasi 80%, infusa konsentrasi 90%, infusa konsentrasi 100%, dan maserat
konsentrasi 70%, maserat konsentrasi 80%, maserat konsentrasi 90%, maserat
konsentrasi 100%. Selanjutnya ke dalam media ini ditambahkan 0,5 ml suspensi
khamir. Tabung reaksi tersebut kemudian diukur absorbansi (Optical Density =
OD) awalnya menggunakan spektrofotometer (λ = 480 nm). Tabung-tabung reaksi tersebut kemudian diinkubasi selama
48 jam pada suhu 37°C dalam inkubator.
Setelah
diinkubasi, tabung reaksi divortex terlebih dahulu sebelum diukur nilai
absorbansinya menggunakan spektrofotometer (λ= 480 nm). KHM ditentukan dengan dengan
menghitung OD setelah perlakuan inkubasi dikurangi OD sebelum inkubasi. Apabila
terdapat konsentrasi terendah yang menghambat pertumbuhan bakteri, ditunjukkan
dengan tidak adanya kekeruhan (OD ≤ 0), maka diperoleh Kadar Hambat minimum
(KHM). Persentase penghambatan KHM secara kuantitatif dapat dihitung dengan
rumus sebagai berikut:
% penghambatan =
x 100%
c. Penentuan
KBM bakteri dan khamir
Sampel yang
tetap jernih setelah inkubasi diambil dan ditumbuhkan pada media agar (PDA untuk
khamir dan NA untuk bakteri) untuk mengidentifikasi adanya pertumbuhan mikroba
setelah diinkubasi pada media agar. Metode yang digunakan adalah metode
hitungan cawan. Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel
mikroba yang masih hidup pada medium agar, sel tersebut akan berkembang biak
membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa
menggunakan mikroskop.
d. Analisis
Statistik
Data dianalisis dengan
analisis ragam dengan menggunakan Analysis of Varian (ANOVA) dengan
selang kepercayaan 1% dan 5%, untuk mengetahui apakah terdapat pengaruh pada
tiap perlakuan. Apabila hasil uji menunjukkan terdapat beda sangat nyata pada
interaksi kedua perlakuan, maka dilanjutkan dengan uji lanjut DMRT (Duncan’s
Multiple Range Test) dengan selang kepercayaan 1%. Apabila tidak terdapat
interaksi namun disalah satu perlakuan atau keduanya terdapat beda nyata atau
beda sangat nyata, maka dilanjutkan dengan uji lanjut BNT (Beda Nyata Terkecil)
dengan selang kepercayaan 1%.
3.4 Diagram
Alir Penelitian
3.4.1
Pembuatan Ekstrak (Ekstraksi)
a. Pembuatan
Ekstrak Daun Gambir Dengan Metode Infus (Diubah dari Magdalena, 2015)
|
Serbuk daun gambir 20 gram
|
|
Aquades dengan rasio bahan:pelarut
= 1:35 (b/v)
|
|
Direbus dalam penangas air panas
suhu 90 °C selama 30 menit sambil diaduk pelan-pelan
|
|
Didinginkan selama 10 menit
|
|
Disaring dua kali dengan dengan
kertas saring halus
|
|
Ekstrak dipekatkan dengan rotary vacuum evaporator selama ±3
jam
|
|
Ditempatkan pada botol kaca yang
telah dilapisi aluminium foil
|
|
Disimpan di kulkas suhu 4°C
|
|
Infusa daun
gambir
|
b. Pembuatan
Ekstrak Daun Gambir Dengan Metode Maserasi (Diubah dari Istiqomah, 2013)
|
Serbuk daun gambir 20 gram
|
|
Aquades dengan rasio bahan:pelarut
= 1:10 (b/v)
|
|
Direndam dalam aquades selama 24
jam pada suhu ruang kedap cahaya dengan pengadukan 120 rpm
|
|
Didinginkan selama 10 menit
|
|
Disaring dua kali dengan dengan
kertas saring halus
|
|
Ekstrak dipekatkan dengan rotary vacuum evaporator selama ±3
jam
|
|
Ditempatkan pada botol kaca yang
telah dilapisi aluminium foil
|
|
Disimpan di kulkas suhu 4°C
|
|
Maserat daun
gambir
|
3.4.2 Prosedur
Penentuan KHM dan KBM
a. Prosedur
Penentuan KHM dan KBM Bakteri (Diubah dari Pratiwi, 2009)
|
Data
|
|
Nilai KBM
|
|
Data
|
|
Nilai KHM
|
|
Inokulum bakteri 0,5 ml
|
|
Media NB 4 ml
|
|
Dimasukkan kedalam tabung reaksi
|
|
Dianalisa OD awal menggunakan
spektrofotometer
|
|
Diinkubasi selama 24 jam, 37oC
|
|
Dianalisa OD akhir menggunakan
spektrofotometer
|
|
Dianalisa secara kualitatif
(perbandingan kekeruhan)
|
|
Plating pada media NA selama 24
jam, 37oC
|
|
Hasil
|
|
0,5 ml ekstrak daun gambir
konsentrasi 70%, 80%, 90%, 100%
|
b. Prosedur
Penentuan KHM dan KBM Khamir (Diubah dari Pratiwi, 2009)
|
Data
|
|
Nilai KBM
|
|
Data
|
|
Nilai KHM
|
|
Inokulum khamir 0,5 ml
|
|
Media PDB 4 ml
|
|
Dimasukkan kedalam tabung reaksi
|
|
Dianalisa OD awal menggunakan
spektrofotometer
|
|
Diinkubasi selama 48 jam, 37oC
|
|
Dianalisa OD akhir menggunakan
spektrofotometer
|
|
dianalisa secara kualitatif
(perbandingan kekeruhan)
|
|
Plating pada media PDA selama 48
jam, 37oC
|
|
Hasil
|
|
0,5 ml ekstrak daun gambir
konsentrasi 70%, 80%, 90%, 100%
|
No comments:
Post a Comment